Wydział Fizyki UW > Badania > Seminaria i konwersatoria > Seminarium Zakładu Biofizyki

Seminarium Zakładu Biofizyki

2006/2007 | 2007/2008 | 2008/2009 | 2009/2010 | 2010/2011 | 2011/2012 | 2012/2013 | 2013/2014 | 2014/2015 | 2015/2016 | 2016/2017 | 2017/2018 | 2018/2019 | 2019/2020 | 2021/2022 | 2022/2023 | 2023/2024

RSS

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

dr Anna Niedźwiecka (Środowiskowe Laboratorium Fizyki Biologicznej IF PAN oraz Zakład Biofizyki IFD WF UW)

Co chcielibyście wiedzieć o biofizyce oddziaływań białek z ligandami, a boicie się zapytać - na przykładzie białek wiążących kap 5’ mRNA

What you would like to know about protein-ligand interactions but are afraid to ask - case studies of the mRNA 5’ cap binding proteins

Dlaczego stałe asocjacji to za mało? Naturalnym językiem biofizycznej analizy oddziaływań i procesów biomolekularnych jest język parametrów termodynamicznych. Podczas seminarium przypomnę o zjawiskach termodynamicznie sprzężonych z oddziaływaniami białko-ligand, metodach ich identyfikacji, pułapkach eksperymentalnych i ich konsekwencjach dla poprawnej analizy wyników.

Why is the concept of an association constant insufficient? The natural language needed for the description biomolecular interaction and processes is based on the thermodynamic parameters. During this seminar, I will remind the phenomenon of thermodynamic coupling of protein-ligand interactions with other accompanying processes. Methods of their identification, experimental pitfalls and their consequences for proper data analysis will be also discussed.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

Gabriela Golba (IFD UW)

Oddziaływanie mutantów Asp204Ala-PNP, Arg217Ala-PNP i Asp204Asn-PNP fosforylazy nukleozydów purynowych z bakterii E. coli z wybranymi ligandami oraz próba uzyskania dobrze rozpraszających kryształów Asp204Asn-PNP

Interaction of the E. coli purine nucleoside phosphorylase mutants (Asp204Ala-PNP, Arg217Ala-PNP and PNP Asp204Asn-PNP) with selected ligands and attempt to obtain well scattering crystals of Asp204Asn-PNP

Bakteryjne fosforylazy nukleozydów purynowych PNP, charakteryzujące się niższą specyficznością niż PNP ze źródeł ssaczych, mogą znaleźć zastosowanie w terapii genowej niektórych nowotworów. Podczas prezentacji zostaną omówione wyniki miareczkowań fluorescencyjnych, których celem było wyznaczenie parametrów charakteryzujących wiązanie mutantów PNP z E. Coli: Asp204Ala-PNP, Arg217Ala-PNP i Asp204Asn-PNP z ligandem – fosforanem. Jeden z mutantów, Asp204Asn-PNP, mimo pochodzenia bakteryjnego przypomina właściwościami PNP ze źródeł ssaczych - nie wiąże adenozyny. Dla tego mutanta przeprowadzono próby uzyskania kryształów umożliwiających wyznaczenie struktury trzeciorzędowej białka. Udało się otrzymać kryształy w roztworach zawierających sole potasowe oraz PEG.

Bacterial Purine nucleoside phosphorylases PNP have less substrate specificity than mammalian that suggest a strategy for gene therapy treatment for tumors. During the presentation the fluorescence titration results will be discussed. The aim of was to determine the kinetic parameters characterizing the interaction of PNP mutants: Asp204Ala-PNP, Arg217Ala-PNP and Asp204Asn-PNP with the phosphate. In spite of bacterial source of Asp204Asn-PNP, it does not bind adenosine like the mammalian PNP. For this mutant crystallization experiments to produce a well scattering crystals were performed. The first crystals have appeared in potassium salts with PEG.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 15:00

Mateusz Dobrowolski (IFD UW)

Badania oddziaływań benzylowych analogów kapu z izoformami ludzkiego białka eIF4E

Structural insights into human eIF4E isoforms interaction with N7-benzylated guanosine cap derivatives

Zbadano powinowactwo serii benzylowanych analogów kapu do trzech izoform ludzkiego białka eIF4E: eIF4E1a, eIF4E1b oraz eIF4E2 (4EHP). Stosując metodę miareczkowania fluorescencyjnego zostały wyznaczone stałe asocjacji dla kompleksów izoform z serią mononukleotydowych, benzylowych i metylowych analogów kapu, różniących się ilością grup fosforanowych oraz dla kompleksów z dinukleotydowymi analogami kapu. Wyniki pokazały podobne powinowactwo benzylowych i metylowych analogów kapu do kanonicznego czynnika inicjacji translacji eIF4E1a oraz izoformy eIF4E2, zaś izoforma eIF4E1b wykazuje zaskakująco wysokie powinowactwo do analogów benzylowych. Pomiary widm CD w zakresie bliskiego nadfioletu, wskazują, iż w wyniku tworzenia kompleksu białko-cap w izoformach eIF4E zachodzą różne zmiany konformacyjne reszt tryptofanów i ich otoczenia, zależne od grupy wprowadzonej w pozycji N7 guaniny analogu kapu.

eIF4E has been found to be overexpressed in a broad spectrum of cancer cells. Due to this fact eIF4E is considered as a target in anticancer therapy. Recently N7-benzylated guanosine cap analogues were reported as effective inhibitors of translation initiation. The binding affinity of N7-benzylated guanosine cap analogs for eIF4E isoforms: eIF4E1a, eIF4E1b and eIF4E2 (4EHP) were investigated. The association constants were obtained for mononucleotide cap analogues with methyl or benzyl group in N7 position of guanine ring, and with one to three phosphate group in the chain, as well as for dinucleotide caps, using time synchronized fluorescence titration. Similar association constants were found for complexes of benzylated and methylated cap analogues with canonical 4E (eIF4E1a) and with eIF4E2 isoform, On the contrary, eIF4E1b reveals much greater affinity for benzyl than for methyl analogues. Additionally, near UV CD spectra of eIF4E-cap complexes were performed, which confirm different conformational changes of tryptophan residues and their close surroundings, due to modification at N7 of the cap analogues.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

Justyna Kosińska (IFD UW)

Właściwości spektroskopowe jednotryptofanowych mutantów fosforylazy nukleozydów purynowych (PNP) ze śledziony cielęcej jako markerów procesu rozwijania białka

Spectroscopic properties of the one tryptophan mutants of purine nucleoside phosphorylases (PNP) from calf spleen as markers of protein unfolding process

Fosforylazy nukleozydów purynowych (PNP) są to białka, które rozszczepiają wiązanie glikozydowe rybo- i dezoksorybonukleozydów w obecności nieorganicznego fosforanu. W wyniku reakcji uwalniana jest zasada purynowa i tworzony jest rybozo- lub dezoksyrybozo-1-fosforan. PNP odgrywa ważną rolę w metabolizmie nukleozydów. Przypuszcza się, że PNP może być stosowane w terapii genowej nowotworów. Podczas prezentacji zostaną omówione wstępne badania procesu rozwijania trzech jednotryptofanowych mutantów PNP (W16 PNP, W94 PNP i W178 PNP) w funkcji stężenia chlorowodorku guanidyny. Badania przeprowadzono za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej.

Purine nucleoside phosphorylase (PNP) catalyzes the cleavage of the glycosidic bond of ribo- and deoxyribonucleosides, in the presence of inorganic orthophosphate (Pi) as a second substrate, to generate the purine base and ribo(deoxyribose)-1-phosphate. PNP plays an important role in the metabolism of nucleosides. It is believed that it can be used in gene therapy of cancer. During the presentation will be discussed preliminary studies of PNP mutants unfolding process as a function of concentration of guanidine hydrochloride. The research was conducted using fluorescence spectroscopy.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

Monika Nowakowska (IFD UW)

Post-syntetyczne modyfikacje analogów końca 5’mRNA zawierających 6-tioguanozynę

Post-synthetic modifications of 5’ end of mRNA cap analogs containing 6-thioguanosine

Podczas seminarium zostanie przedstawione opracowanie nowych analogów kapu, które mogłyby służyć do badań partnerów oddziałujących z kapem, w tym białek eIF4E i DcpS. w warunkach komórkowych Zsyntetyzowane analogi kapu zawierają w strukturze 6-tioguanozynę, która dzięki swoim właściwościom spektroskopowym, może zostać zastosowana do fotozszywania. Jako przykład tej techniki zostanie przedstawiony eksperyment mapowania kieszeni wiążącej kap występującej w mRNA kodującym histon H4. Dodatkową zaletą analogów kapu zawierających 6-tioguanozynę jest możliwość ich post-syntetycznego modyfikowania. Cechę tą wykorzystano do wprowadzenia znaczników fluorescencyjnych i nowych grup funkcyjnych, które pozwoliły na dalsze modyfikacje. Otrzymane związki stanową cenne narzędzia w badaniach biofizycznych i biologicznych nad procesami zależnymi od kapu.

Cap structure is recognized by many biomacromolecules It became a strong motivation for development of new tools for studies on cap-binding proteins, eIF4E and DcpS. During the seminar new cap analogues will be presented, which could be used as a tools for studies of in vivo cap-target interaction. The synthesized cap analogues containing 6-thioguanosine are useful for photo cross-linking experiments. They have been used for mapping the cap binding pocket of mRNA encoding histone H4. 6-thioguanosine is also useful for post-synthetic modification of cap analogues. It allows selective introduction of fluorescent dyes (coumarin, pyrene) and functional groups (carboxyl, alkyne) using S-alkylation reaction. Such compounds could be potentially useful as valuable tools in biophysical and biological investigations of cap dependent processes.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 15:00

Renata Kasprzyk (IFD UW)

Analogi kapu znakowane pirenem jako sondy molekularne do badań białek wiążących koniec 5’mRNA

Pyrene labeled cap analogs as molecular probes for studying proteins binding 5’ mRNA end

Pochodne pirenu są szeroko stosowane do znakowania nukleotydów i kwasów nukleinowych. Znakowane nukleotydy posiadają ciekawe właściwości fluorescencyjne związane z tworzeniem ekscymerów, których emisja silnie zależy od otoczenia i lokalnego stężenia reszt pirenowych. W prezentacji zostanie przedstawiona metoda syntezy analogów końca 5’mRNA (kapu) znakowanych acetylopirenem w terminalnej pozycji łańcucha fosforanowego. Zbadana została zależność emisji ekscymerowej od takich czynników jak stężenie związku, temperatura, pH, rozpuszczalnik, czy też dodatek wygaszacza (tlenku grafenu). Znakowane nukleotydy mogą znaleźć zastosowanie do tworzenia biosensorów, służących do badania białek oddziałujących z końcem 5’mRNA, w tym eIF4E (marker nowotworowy) oraz enzymu degradacji kapu DcpS.

Pyrene derivatives are commonly used in fluorescent labeling of nucleotides and nucleic acids. Labeled nucleotides have interesting fluorescent properties due to formation of excimers, with the emission strongly dependent on chemical environment and local pyrene concentration. In the presentation, a method will shown for synthesis the mRNA 5’ end analogues labeled with pyrene at the terminal position of the oligophosphate chain. Properties of the synthesized compounds were studied by absorption and emission UV-Vis spectroscopy. Excimer fluorescence dependence on such factors as: compound concentration, temperature, pH, solvent and presence of quencher, graphene oxide, were studied. Labeled nucleotides can be applied to create biosensors for studying proteins, which bind the mRNA 5' end, including eIF4E (tumor marker) and decapping scavenger enzyme DcpS.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

Marek Baranowski (IFD UW)

Fluorofosforanowe analogi nukleotydów jako sondy molekularne w badaniach 19F NMR - synteza, właściwości i praktyczne zastosowania

Nucleotides analogues with fluorophosphate moiety as molecular probes in 19F NMR studies - synthesis, properties and practical applications

Atom fluoru jest powszechnie wprowadzany do cząsteczek biologicznych zmieniając m.in. ich właściwości farmakodynamiczne lub/i farmakokinetyczne oraz nadając możliwość detekcji spektroskopowej. Właściwości spektroskopowe fluoru takie jak wysoki współczynnik magnetogiryczny, spin ½, 100% abundancja, duża dyspersja przesunięć chemicznych czynią go idealnym narzędziem w badaniach NMR. Podczas prezentacji przedstawione zostaną trzy syntetyczne podejścia pozwalające na syntezę nukleotydów z ugrupowaniem fluorofosforanowym, stanowiących potencjalne narzędzia do badań 19F NMR. Połączenie tych metod pozwoliło na otrzymanie ponad 30 nukleotydów oraz 2 oligonukleotydów zawierających ugrupowanie fluorofosforanowe. Otrzymane związki zostały scharakteryzowane metodami 19F NMR jako sondy molekularne. Wstępne badania wskazują, że fluorofosforanowe analogi nukleotydów mogą zostać wykorzystane jako substraty reporterowe do monitorowania aktywności enzymów i ligandy do badania oddziaływania z białkami. Fluorofosforylowane oligonukleotydy mogą być potencjalnie użyteczne jako sondy do badania hybrydyzacji.

Fluorine atom is commonly introduced into biological molecules changing their pharmacokinetic or/and pharmacodynamic properties. Fluorine spectroscopic properties such as high magnetogyric coefficient, spin ½, 100% abundance and large chemical shift dispersion makes him an ideal tool in NMR studies. During presentation three synthetic approaches to nucleotides with fluorophosphate moiety will be presented. The synthetic methods enabled us to obtain more than 30 nucleotides and 2 oligonucleotides containing fluorophosphate moiety. The compounds were characterized by 19F NMR, and evaluated as 19F NMR molecular probes. We found that fluorophosphate nucleotide analogs can be used to monitor activity of enzymes with various specificities and metal-ion requirements. The compounds can also serve as reporter ligands for protein binding studies. The fluorophosphorylated oligonucleotides are potentially useful as 19F NMR hybridization probes obtained from CGMD simulations and their geometry characterization will be presented.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

Maciej Ciemny (IFD UW)

Dimeryzacja receptorów opioidowych - badanie metodami gruboziarnistej dynamiki molekularnej

Dimerization of opioid receptors - investigations by coarse grained molecular dynamics

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) stanowią największą znaną rodzinę białek transbłonowych w ludzkim genomie. W ostatnim czasie proces dimeryzacji GPCR jest intensywnie badany, a otrzymywane dane doświadczalne sugerują, że receptory opioidowe, należące do tej rodziny, tworzą in vivo funkcjonalne dimery. Wobec tego zrozumienie zjawiska dimeryzacji może prowadzić do stworzenia precyzyjnych terapii celowanych na wybrany rodzaj dimeru. By zbadać ten proces, zastosowano symulacje gruboziarnistej dynamiki molekularnej (CG MD). Uzyskane tą metodą struktury homodimerów receptorów opioidowych oraz ich geometryczna charakterystyka zostaną przedstawione podczas seminarium.

G-protein coupled receptors (GPCRs) constitute the largest known transmembrane receptor protein family in the human genome. Recently, the GPCRs dimerization is intensely investigated and the resulting experimental results suggest that the opioid receptors, among other GPCR family members, form functional dimers in vivo. Thus, the understanding of dimerization may potentially lead to pharmacological therapies precisely targeted at selected dimer type. To investigate this phenomena, coarse grained molecular dynamics (CG MD) simulations were performed. The opioid receptor homodimer structures obtained from CGMD simulations and their geometry characterization will be presented.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

mgr Małgorzata Piątkowska (IFD UW)

Badanie zmian w strukturze drugorzędowej białek wywołanych zewnętrznymi czynnikami fizycznymi z wykorzystaniem metody ATR-FTIR

The study of changes in the secondary structure of proteins caused by external physical factors using ATR-FTIR method

Technika tłumionego całkowitego odbicia (ang. Attenuated Total-internal Reflection - ATR) wykorzystywana w spektroskopii podczerwieni z transformatą Fouriera (FT-IR) w ostatnich latach zrewolucjonizowała badania struktur drugorzędowych białek. Korzystając właśnie z tej metody badano struktury białek biologiczne aktywnych oraz sprawdzano jak zmieniało się ich widmo po inkubacji w temperaturze określonej jako denaturująca. Wykorzystano białka o znanych strukturach natywnych, których budowa jest całkowicie α-helikalna, β-kartkowa i mieszana α/β.

The Attenuated Total-internal Reflection (ATR) technique used in Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy has revolutionized studies of secondary structures of proteins in recent years. Using this method structures of biology active proteins were measured. It was also checked how the FTIR spectrum has changed after incubation in the temperature that caused denaturation. Crystal structures of the investigated proteins were well known and contained only α-helixes or β-sheets or both.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

mgr Michał Górka (IFD UW)

Przypisywanie przesunięć chemicznych grup bocznych aminokwasów w spektroskopii NMR białek

Resonance assignment of amino-acid side-chains in protein NMR spectroscopy

W badaniach struktury białek metodami spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) szczególnie ważne jest uzyskanie informacji odnoszących się do wchodzących w obręb tzw. rdzenia hydrofobowego białka łańcuchów bocznych aminokwasów aromatycznych oraz hydrofobowych alifatycznych. Ponieważ reszty boczne różnych typów aminokwasów różnią się strukturą chemiczną, wykonanie dla nich przypisania przesunięć chemicznych jest zagadnienie złożonym i brak jest uniwersalnej metodologii umożliwiającej wykonanie takiego przypisania. W prezentacji zostaną krótko scharakteryzowane sposoby przypisywania zarówno alifatycznych, jak i aromatycznych grup bocznych białek wraz z wykorzystywanymi do tego celu eksperymentami. Przedstawione zostaną także propozycje zmodyfikowanych eksperymentów, które powinny się cechować zwiększonym zakresem stosowalności.

Data pertaining to the aromatic and hydrophobic aliphatic amino-acid side-chains is of particular importance in the study of protein structure using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. As the side-chains of different types of amino-acids vary in chemical structure, finding their resonance assignment is a complex task and there is no generally applicable methodology. During the talk a short description will be given of the methods used to complete such the assignments for both aromatic and aliphatic amino-acids as well as the experiments employed. Several propositions of modified experiments will also be presented, which should exhibit increased applicability.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

mgr Marcin Sobieraj (IFD UW)

Wektorowy autoregresyjny model analizy przyczynowości dla układów (bio)molekularnych z przykładami

Vector autoregressive model of causality analysis for (bio)molecular systems with examples

Rozpoznanie relacji przyczynowych pomiędzy zdarzeniami obserwowanymi w dynamikach (bio)molekularnych ma kluczowe znaczenie dla ich opisu oraz zrozumieniu sposobu funkcjonowania. Podczas seminarium przedstawiony zostanie matematyczny model pozwalający badać relacje przyczynowo-skutkowe pomiędzy wielokanałowymi sygnałami wektorowymi. Model ten bazuje na metodach analizy opracowanych początkowo na potrzeby ekonomii. Za prace nad tymi metodami dwóch ekonomistów: Clive Granger i Robert Englem otrzymało w roku 2003 nagrodę Nobla z ekonomii. W odróżnieniu od oryginalnych metod badających przyczynowość pomiędzy sygnałami skalarnymi, metoda zaprezentowana na seminarium pozwala badać przyczynowość pomiędzy sygnałami wektorowymi. Ponadto, przedstawiona zostanie analiza przyczynowości dla modelowych układów molekularnych wykonana w oparciu o rozwijany model.

Detection of causal relations between events observed in molecular dynamic simulations is of key importance for the understanding of behaviour and functioning of complex (bio)molecular systems. During the seminar a mathematical model will be presented to examine the causal relations between multi-channel signals vector. This model is based on analytical methodology developed initially for economy by Clive Granger and Robert Engel, who received Nobel Prize in economy in 2003. In contrast to previous methods of examining the causality between scalar signals, the method presented at the seminar deals with causality between vector signals. Additionally, the analysis of causality will be presented for molecular systems based on the developed model.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

mgr Anna Nowicka (IFD UW)

Technika polaryzacji fluorescencji w poszukiwaniu inhibitorów

Fluorescence polarization technique for inhibitor screening

W celu znalezienia cząsteczek wiążących się z celami molekularnymi często wykorzystuje się metody fluorescencyjne ze względu na ich czułość, szybkość i prostotę przeprowadzenia eksperymentu. Coraz większą popularnością w badaniach oddziaływań cieszy się technika polaryzacji fluorescencji, która jest także stosowana w formacie wysokoprzepustowym. Na seminarium zostaną przedstawione przykłady wykorzystania tej techniki w poszukiwaniu inhibitorów.

In order to find the molecules which are bound to the molecular target, the fluorescent techniques are often used because of their sensitivity, simplicity and speed of the experiment. The popularity of the fluorescence polarization technique in the study of interactions is still growing, also in the high throughput format. During the seminar examples will be presented of using the fluorescence polarization to find inhibitors.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

mgr Przemysław Wanat (IFD UW)

Nukleotydowe sondy do monitorowania aktywności enzymatycznej: projektowanie i zastosowania

Nucleotide molecular probes for monitoring enzymatic reactions: design and applications

Sondy molekularne to cząsteczki które pod wpływem przebiegu reakcji enzymatycznej lub wiązania do innej molekuły (np. białka) wykazują efekt, który może być mierzalny makroskopowo. W trakcie seminarium będą omówione przykłady eksperymentów, w których do badania procesów biologicznych wykorzystano efekty wygaszania fluorescencji, zmiany długości fali emisji (wg mechanizmu FRET), albo zmiany sygnału EPR dwóch sprzężonych znaczników rodnikowych, w odpowiednio zmodyfikowanych cząsteczkach ATP. Na koniec zostanie zaprezentowana zsyntetyczna, znakowana pirenem, fluorescencyjna sonda na bazie ATP, o potencjalnym zastosowaniu w badaniu aktywności pirofosfataz.

Molecular probes are a special type of compounds that exhibit a macroscopically measured effect upon a chemical reaction or binding to another molecule, e.g. protein. During the seminar the experiments will be presented, in which appropriately modified ATP analogues were used for studying biological processes based on fluorescence quenching effect, changes of emission spectra by FRET mechanism or changes of EPR signals of two conjugated radical tags. Finally, a pyrene-labeled, fluorescent, ATP probe, will be demonstrated regarding potential applications for studying pyrophosphatase activity.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

mgr Maja Cieplak-Rotowska (IFD UW)

Badanie oddziaływań między białkami CNOT1 i TNRC6C metodą wymiany proton-deuteron sprzężoną ze spektrometrią mas

Studying protein-protein interactions between CNOT1 and TNRC6C using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry

W trakcie seminarium będzie omówiona metoda wymiany proton-deuteron sprzężona ze spektrometrią mas, w kontekście badania oddziaływań między białkami. Następnie zostaną przedstawione wyniki badań oddziaływania między białkami CNOT1 i TNRC6C. Białka te są zaangażowane w bardzo ważny biologicznie proces wyciszania ekspresji genów przez miRNA.

During this seminar it will be explained how hydrogen-deuterium exchange detected by mass spectrometry can be applied to study protein-protein interactions. Results of the studies on CNOT1-TNRC6C interactions will be presented. These two proteins are involved in a very important biological process called miRNA - mediated gene silencing.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

mgr Marcin Warmiński (IFD UW)

Synteza oligonukleotydów na podłożu stałym

Solid-phase oligonucleotide synthesis

Podczas seminarium zostaną omówione zarówno teoretyczne, jak i praktyczne aspekty syntezy oligonukleotydów w fazie stałej, a także możliwości i ograniczenia syntetyzera DNA/RNA AKTA Oligopilot, znajdującego się na wyposażeniu Zakładu Biofizyki. Prelegent przedstawi kilka opisanych w literaturze metod modyfikacji tych związków, istotnych w kontekście chemicznej syntezy fragmentów oligonukleotydowych zakończonych strukturą kapu oraz swoje dotychczasowe postępy w tej dziedzinie.

The seminar will be devoted to both theoretical and practical aspects of solid-phase oligonucleotide synthesis, and to discussion of the possibilities and constraints of DNA/RNA AKTA Oligopilot synthesizer that our division is equipped with. Some methods of oligonucleotide modifications described in literature will be also presented, especially those, important for the synthesis of 5’-capped RNAs, including recent development in this matter.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

mgr Małgorzata Żytek (IFD UW)

Syntetyczne analogi trimetyloguanozyno kapu modyfikowane w mostku trifosforanowym jako narzędzia do badania snurportyny i optymalizacji sygnału transportu dojądrowego dla czynników terapeutycznych

Evaluation of biological activity of enzymatically stable trimethylguanosine cap analogs modified within 5’,5’-triphosphate bridge as a nuclear localization signal

Struktura trimetyloguanozyno (TMG) kapu występuje na końcu 5’ małych, niekodujących fragmentów RNA - tzw. snRNA (ang. small nuclear). Składa się z trimetyloguanozyny połączonej mostkiem trifosforanowym z pierwszym nukleozydem łańcucha RNA. Jest odpowiedzialna za transport snRNA do jądra komórkowego poprzez oddziaływanie z białkiem adaptorowym – snurportyną. Przyłączenie TMG kapu do innych makrocząsteczek o znaczeniu terapeutycznym (np. oligonukleotydów) umożliwia ich import do jądra komórkowego. TMG kap ulega w komórce enzymatycznej degradacji. Enzymem, którego udział dotychczas w tym procesie potwierdzono, jest Nudt16 z rodziny hydrolaz NUDIX. Na seminarium zostaną zaprezentowane wyniki badań, które miały na celu otrzymanie syntetycznych analogów TMG kapu odpornych na degradację enzymatyczną oraz cechujących się zwiększonym powinowactwem do snurportyny. Zaprezentowana zostanie zarówno synteza chemiczna analogów TMG kapu modyfikowanych w mostku trifosforanowym, jak i wyniki badań ich oddziaływania ze snurportyną, przeprowadzonych przy użyciu metody miareczkowania fluorescencyjnego.Zsyntezowane analogi TMG kapu stanowią nową klasę narzędzi, które posłużą do badań procesu transportu dojądrowego oraz innych procesów, w których uczestniczy TMG kap. Badania te mogą mieć również praktyczne znaczenie, dostarczając istotnych informacji przy opracowywaniu terapii chorób, których źródło leży w jądrze komórkowym (np. dystrofia mięśniowa Duchenne’a).

The trimethylguanosine (TMG) cap structure is found at 5’-end of small nuclear RNAs of eucaryota. It consist of N2,N2,N7-trimethylguanosine connected via 5’,5’-triphosphate bond to the first nucleotide of RNA chain (m3GpppN). In higher organisms, including humans, the TMG cap structure is involved in nucleomembrane transport. In the cytoplasm it is recognized by an adaptor protein, snurportin 1, and then with a help of importin β the construct can be translocated through the nuclear pore complex. The interaction between TMG cap and snurportin is essential for efficient nucleomembrane transport. This unique feature of TMG cap can be used for transport of therapeutic macromolecules dedicated to work in the nucleus. The TMG cap can be also degraded by hydrolases from the NUDX family - e.g. human NUDt16 which cuts the TMG cap structure resulting in N2,N2,N7-trimethylguanosine 5’-diphosphate and snRNA chain. During the seminar I will present the chemical synthesis of TMG cap analogs modified within 5’,5’-triphosphate bridge and the results of binding studies between snurportin 1 and synthesized compounds. These studies were performed using a titration assay based on quenching of the intrinsic protein fluorescence by cap analogs. The newly synthesized TMG cap analogs constitute a class of enzymatically stable and efficient tools for nuclear import of nucleus targeting drugs.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

mgr Malwina Strenkowska (IFD UW)

Analogi kapu modyfikowane dwiema grupami tiofosforanowymi - synteza oraz wpływ na stabilność i translację mRNA w warunkach komórkowych

Cap analogues modified with two thiophosphate moieties - synthesis and impact on the stability and translation levels in the cell

Celem projektu jest synteza i wykorzystanie niehydrolizowalnych pochodnych nukleotydów do stabilizacji cząsteczki mRNA oraz zwiększenia jej potencjału translacyjnego w warunkach komórkowych. Jest to szczególnie ważne w zastosowaniach mRNA do celów terapeutycznych, np. immunoterapii nowotworów za pomocą mRNA, gdzie trwałość mRNA przekłada się bezpośrednio na ilość powstającego w komórkach terapeutyka, a co za tym idzie na skuteczność terapii. Do kluczowych elementów mRNA wpływających na jego stabilność należy 5’-kap. Modyfikacje 5’-kapu pozwalają na zwiększenie trwałości i wydajności translacyjnej mRNA. Najbardziej znanym przykładem jest diastereoizomer D1 ARCA z grupą tiofosforanową, który zachęcił do szukania nowych analogów kapu podwyższających jakość mRNA. W wyniku tych poszukiwań została zsyntetyzowana seria nowych dinukleotydowych analogów kapu, posiadających dwie modyfikacje tiofosforanowe wewnątrz mostka oligofosforanowego. W trakcie seminarium zostanie zaprezentowana ich synteza oraz wyniki badań wpływu modyfikacji na wydajność translacji mRNA w komórkach dendrytycznych.

The main goal of the project is the synthesis and application of non-hydrolyzable cap-analogues to stabilize mRNA molecule and to stimulate its translational potential in the cell. These aspects are exetremely important for therapeutic applications of mRNA such as mRNA-based cancer immunotherapies. One of the crucial parts of mRNA molecule that influences its stability is the 5' cap structure. Modifications of the cap enable to increase stability and translational potential of mRNA. One of the most acknowledged and successful example is the thiophosphate modification in the oligophosphate chain resulting in the diastereoisomer D1 of S-ARCA. It has encouraged searching for new cap analogues with even better-tuned qualities for obtaining stable and efficient mRNAs. As a result, a series of new dinucleotide cap analogues has been synthesized, containimg two thiophosphate modifications in the oligophosphate bridge. The synthesis of the new cap analogues will be presented as well as some results of mRNA translation studies in dendritic cells.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:15

mgr Maciej Dziubiński (IFD UW)

Analiza kooperacji wewnątrz cząsteczek przy przejściach wzdłuż zadanej współrzędnej reakcji

Analysis of intramolecular cooperation during a transition along a given reaction coordinate

Przedstawiony zostanie nowo opracowany algorytm służący do identyfikacji części układów (bio)molekularnych, które poprzez wzajemne oddziaływania wpływają na dynamikę badanego układu, ,,przesuwając'' go wzdłuż zadanej współrzędnej reakcji. Uzyskana w ten sposób wiedza pozwala lepiej zrozumieć zachowanie maszyn molekularnych, których funkcja wymaga znaczących zmian strukturalnych, tzw. ,,przejść'' między stanami meta-stabilnymi. Słuchacze zapoznają się z metodą, wynikami uzyskanymi dla prostej, 11-atomowej cząsteczki oraz zaletami i wadami nowego podejścia, a także możliwościami aplikacyjnymi.

A newly developed algorithm will be presented for identifying parts of the (bio)molecular systems, which utilize intramolecular interactions to direct the dynamics of the studied system, "pushing" it along a given reaction coordinate. The algorithm provides an insight that may prove helpful in understanding the mechanics of molecular machines which, in order to work, need to undergo structural transitions between their meta-stable states. The participants will acquainted with the method, the results for a simple, 11-atomic molecule, and the advantages and disadvantages of the new approach, as well as its possible applications.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:00

mgr Marcin Ziemniak (IFD UW)

Modyfikowane analogi kapu jako inhibitory kompleksu dekapującego Dcp1/2

Modified cap analogues as inhibitors of Dcp1/2 decapping complex

Kompleks Dcp1/2 jest głównym enzymem dekapującym a jego aktywność jest kluczowa dla obiegu mRNA. Kompleks ten jest zbudowany z dwóch podjednostek: Dcp1 jest jednostką regulatorową podczas gdy Dcp2 jest odpowiedzialny za aktywność katalityczną. Sam Dcp2 jest zbudowany z dwóch domen, jedna ma charakter regulatorowy a druga zawiera centrum katalityczne. Pomimo, że Dcp2 jest pirofosfatazą wiążącą się jedynie do łańcucha RNA to jego domena regulatorowa wiąże, ale nie hydrolizuje nukleotydy zawierające m7G. Z tego powodu spekulowaliśmy, że takie związki mogą być inhibitorami Dcp2. Dlatego też wybrano grupę analogów kapu modyfikowanych w łańcuchu fosforanowym, by wykonać badania przesiewowe pod kątem inhibicji Dcp1/2. Odkryto, że szereg związków posiadających modyfikację tio- lub boranofosforanową jest inhibitorami Dcp1/2. Następnie związek o najsilniejszych właściwościach inhibitorowych, m7GpSpppSm7G został wybrany do dalszych badań kinetycznych i strukturalnych. Eksperymenty NMR pozwoliły na zmapowanie miejsca wiązania i obliczenie powinowactwo do obydwu domen Dcp2. Pomiary kinetyczne wskazały, że wymieniony związek jest mieszanym inhibitorem, posiadającym wyższe powinowactwo do wolnego enzymu niż kompleksu enzym-substrat. Do tej pory jest to pierwszy dowód na to, że małocząsteczkowy ligand jest zdolny do hamowania aktywności Dcp1/2 in vitro.

Dcp1/2 complex is the major decaping enzyme, which is crucial for mRNA turnover. The complex is composed of two subunit: Dcp1 which is a regulatory unit and Dcp2 which is responsible for the catalytic activity. Dcp2 itself comprises two domains, the first one is a regulatory domain and the second one contains the catalytic centre. Despite being a RNA-dependent pyrophosphatase, Dcp2 regulatory domain recognise, but not hydrolyse, m7G-containing nucleotides. Due to that we hypothesised that Dcp1/2 may be inhibited by such compounds. Hence, a number of synthetic cap analogues, bearing various modifications in the phosphate chain, was subjected to an enzymatic screening. It has been found that some of tested compounds, having either thio- or boranophosphate modification, act as Dcp1/2 inhibitors. Then, a most potent inhibitor, m7GpSpppSm7G, was selected to kinetic and structural studies. NMR experiments allowed to map the potential binding site and calculate the affinity to both domains of Dcp2. Kinetic assays indicated that mentioned compound is a mixed inhibitor, which has higher affinity to the free enzyme than to the enzyme-substrate complex. Up to know, this is the first evidence that small-molecule ligand is capable of attenuating Dcp1/2 activity in vitro.

Zapraszamy do IGF, sala 109, ul. Pasteura 7 o godzinie 14:00

mgr Małgorzata Prokopowicz (IFD UW)

Charakterystyka kompleksów mutantów fosforylazy nukleozydów purynowych z E. coli z ligandami, na podstawie analizy transferu energii

Characteristics of the complexes of E. coli purine nucleoside phosphorylase and its mutants with ligands by analysis of the energy transfer

Podczas prezentacji będzie przedstawiony krótki opis enzymu, fosforylazy nukleozydów purynowych, oraz teorii transferu energii. W dalszej części będzie omówiona część wyników uzyskanych w trakcie dotychczasowej pracy. Będą one związane z tworzeniem kompleksów enzymu z wybranym ligandem, na podstawie obserwacji obecności lub braku transferu energii oraz zależności od pH roztworu.

A short characterisation of purine nucleoside phosphorylase will be presented, as well as a brief theory of the energy transfer. Subsequently, a part of the experimental results will be shown, concerning creation of the enzyme - ligand complexes. The data are based on the observations of the presence or absence of the energy transfer at various pH.