Seminarium Zakładu Biofizyki

Degradacja mRNA jest jednym z mechanizmów regulacji ekspresji genów przez komórki. Sygnałem do jej rozpoczęcia może być proces dekapingu, w trakcie którego usuwana jest unikalna struktura kapu, znajdująca się na 5’ końcu eukariotycznego mRNA – 7-metyloguanozyna, połączona wiązaniem 5’-5’ trifosforanowym z pierwszym transkrybowanym nukleozydem. Niektóre wirusy (np. pokswirusy) posiadają własne enzymy dekapujące, ale ich dokładna rola w infekcji wirusowej nie jest do końca poznana. Jednym z przykładów jest wirus krowianki i jego enzym dekapujący D9. Jest to hydrolaza z rodziny Nudix, która rozpoznaje strukturę m7G w cząsteczce mRNA i przecina wiązanie pirofosforanowe uwalniając m7GDP. W efekcie prowadzi to do degradacji mRNA gospodarza i zahamowania syntezy białek. W trakcie seminarium zaprezentowane zostaną wyniki badań aktywności enzymu D9 oraz badań inhibitorowych przy użyciu rozwiniętej w naszym laboratorium metody opartej na fluorescencji. Jest to wysokoprzepustowa metoda pozwalająca na przetestowanie dużej liczby związków w krótkim czasie w celu znalezienia niskocząsteczkowych, silnych inhibitorów enzymu D9. Otrzymane wyniki pomogą lepiej zrozumieć aktywność tego enzymu, a ponadto już dostarczyły nowych informacji o wpływie modyfikacji cząsteczki wyjściowej na jej siłę oddziaływania z białkiem i posłużą lepszemu projektowaniu nowych potencjalnych inhibitorów.

Messenger RNA degradation is one of the mechanisms that is used by cells to regulate their gene expression and it could be initiated by decapping, the process during which the protective cap structure from the 5' end of target mRNA is removed. The major eukaryotic RNA decay enzyme is Dcp2 and in complex with its activator Dcp1 it is responsible for decapping of full-length mRNAs. Some viral proteins (e.g. from poxviruses) also possess this hydrolytic activity but their role in viral infection has not been completely understood yet. Vaccinia virus decapping enzyme D9 recognizes m7G-cap and cleaves the pyrophosphate bond between α and β phosphates, releasing m7GDP and the 5′-monophosphorylated RNA body. This in turn leads to the mRNA degradation and shutdown of host protein synthesis. To study the activity of D9 and identify some small molecules that could act as potential D9 inhibitors we propose a simple fluorescence-based assay with pyrene-labelled m7G nucleotide as an activity probe. We used this approach to monitor the fluorescence intensity changes upon enzymatic cleavage on a 96-well plate reader in the presence of compounds that can modulate the protein activity of D9 decapping enzyme. The data may significantly advance our understanding of the decapping process during viral infection.